sábado, 16 de janeiro de 2016

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA - ASPECTOS GERAIS


Avaliação Toxicológica - aspectos gerais

DEPTO. ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
FACULDADE DE FARMÁCIA
UNIVERSIDADE   FEDERAL  DE  MINAS  GERAIS

Profa. Edna Maria Alvarez Leite

Profa. Leiliane Coelho André Amorim


Todas as substâncias químicas são tóxicas em certas condições de exposição. No entanto, para toda substância deve haver alguma condição de exposição que seja segura no que se refere à Saúde Humana, com a possível exceção dos agentes carcinogênicos e mutagênicos.

Ou seja, condições de exposição nas quais as substâncias químicas sejam mantidas abaixo dos níveis máximo permitido. E quando não for possível definir um limite máximo permitido, deve-se evitar a exposição.

         Os dados sobre seres humanos relativos à toxicidade das substâncias químicas, obviamente são mais pertinentes para avaliação da segurança que os dados obtidos em animais experimentais.

No entanto, as exposições controladas de seres humanos à substâncias perigosas ou potencialmente perigosas vêm-se restringidas por considerações éticas e por isso é necessário confiar na informação obtida por métodos clínicos e epidemiológicos.

Todavia, quando esta informação não é disponível, como ocorre com substâncias químicas novas, devem-se obter dados somente mediante os testes de toxicidade realizados com animais.

         O grau de confiabilidade com o qual pode-se estimar os riscos para saúde humana baseado nos testes de toxicidade em animais depende da qualidade dos dados, assim como da quantidade e tipos dos testes realizados.

1 - Conceito

         A avaliação toxicológica compreende a análise de dados toxicológicos de uma substância química com o objetivo de classificá-la em categorias toxicológicas, e ao mesmo tempo, fornecer informações à respeito da forma correta e segura de uso, bem como medidas de prevenção e tratamento.

2 - Prioridades na seleção de substâncias que se submeterão aos testes toxicológicos

         A princípio, todas as substâncias químicas novas devem se submeter a uma avaliação de seguridade antes de sua fabricação e venda. Entretanto, devido ao grande número de substâncias químicas que se representa um possível perigo para a saúde humana e a limitação de recursos é necessário dar prioridade à aquelas que são diretamente consumidas pelo homem, como fármacos, os aditivos alimentares e as que se utilizam amplamente como praguicidas ou produtos domissanitários.

         As substâncias químicas industriais que podem estar presentes no meio ambiente geral ou do trabalho ou contaminar outros produtos representam outra categoria de problemas.

A máxima prioridade deve corresponder aos compostos de presumida toxicidade elevada, aguda, crônica ou diferenciada (como a carcinogenicidade) ou de maior persistência no meio ambiente.

Isto se aplica também aos compostos que inibem a desativação metabólica de substâncias químicas, pois podem constituir uma forma mais insidiosa de toxicidade. As substâncias químicas resistentes ao metabolismo, em especial ao metabolismo pela microflora, terão uma elevada persistência ambiental.

Muitos compostos halogenados se encontram nesta categoria e, em consequência, deverão Ter algum grau de prioridade.

Também interessam os compostos que se acumulam nas cadeias alimentares que se depositam no organismo, por exemplo, o metilmercúrio e o DDT.

         Em suma os critérios essenciais para determinação da prioridade para seleção das substâncias químicas que se colocará à prova são os seguintes:

Ø indicação ou suspeita de perigo para a saúde humana e tipo de gravidade dos efeitos potenciais à saúde.
Ø grau provável de produção e emprego
Ø potencial de persistência no meio ambiente
Ø potencial de acumulação na    e no meio ambiente, e
Ø tipo e magnitude das populações que estarão expostas

         A substância química de primeira prioridade para as provas será aquela que se classifique em lugar destacado em virtude de todos estes critérios ou de sua maioria.

3 - Alcance que devem ter os testes de toxicidade

         O alcance das provas de toxicidade necessárias (ou requeridas) dependerá de algumas considerações. Como primeiro passo poderá ser útil realizar uma estimativa aproximada de toxicidade com base na estrutura química e nas propriedades físico-químicas da substâncias e as correlações conhecidas destas variáveis com a atividade biológica. Estas considerações serão úteis para adotar decisões a respeito das medidas de segurança durante os trabalhos de laboratório.

         A avaliação preliminar de toxicidade deverá começar quando sintetizam as substâncias químicas na fase de Laboratório de Desenvolvimento de um processo industrial. A avaliação completa das substâncias químicas em questão, tanto a respeito da exposição profissional como da exposição da população geral, e a avaliação de possível contaminação de água, ou dos alimentos, deverão iniciar mais tarde, quando já tem-se resolvido levar adiante a produção. Ou seja, no caso de medicamento, os testes toxicológicos são realizados após as triagens farmacológicas, uma vez comprovados seus efeitos terapêuticos.

         Os dados de toxicidade obtidos durante as etapas de desenvolvimento de um processo tecnológico podem ser fontes de dados a respeito dos perigos sobre a saúde, não somente das matérias primas, mas também de outras substâncias utilizadas ou produzidas, como produtos intermediários, no processo tecnológico. Além disso, a avaliação toxicológica pode facilitar a seleção de um processo tecnológico substutivo que seja menos nocivo para a saúde.

         Na definição de normas ambientais e sanitárias e necessário dar preferência ‘as substâncias químicas que manifestem um grau significativo de toxicidade e constituem um perigo de saúde, as quais serão utilizadas amplamente na Indústria, na agricultura e os produtos de consumo. É importante considerar que, as mudanças e a evolução dos processos industriais, a formulação de novas substâncias químicas e as modificações no emprego das substâncias químicas conhecidas podem propor novos e maiores perigos. E isso requer uma constante reavaliação das prioridades.

4 - RELAÇÃO DOSE-EFEITO E RELAÇÃO DOSE-RESPOSTA

         Os estudos das alterações causadas pelas substâncias químicas tem por objetivo estabelecer as relações dose-efeito e dose-resposta que fundamentam todas as considerações toxicológicas necessárias para avaliação do risco à saúde.

         Os estudos relativos à exposição química objetivando medidas de prevenção dos efeitos nocivos à saúde é necessário existir disponível uma medida quantitativa da relação entre a magnitude da exposição ao agente químico e o tipo e grau de resposta numa população exposta a esse agente. É somente com base nessa relação que se pode, seguramente, permitir uma dose tolerável do agente nocivo, em algum nível acima do zero, de tal modo que uma fração significativa do grupo exposto não experimente um indesejável efeito sobre a saúde

         Para uma melhor compreensão da diferença entre os dois tipos de relações, torna-se necessário conceituar dose, efeito e resposta. A expressão Dose se emprega para especificar a quantidade de uma substância química administrada, a qual pode não ser idêntica à dose absorvida. Nas exposições ambientais pode-se estimar a dose com base na medição das concentrações ambientais em função do tempo. E a dose nos orgãos e tecidos que interessam, pode-se estimar com base na quantidade administrada ou injerida; ou na medida da concentração em amostras biológicas. A informação para estimar a dose nos tecidos ou orgãos requer dimensionar os processos de absorção , distribuição, armazenamento, biotransformação e excreção da substância química ou seus metabólitos, em função do tempo.

         Quando a ação tóxica se manifesta no local de introdução ou muito próximo deste ( por exemplo, a pele ) a estimativa da dose no tecido pode ser muito confiável. Entretanto, quando a ação tóxica se manifesta em algum outo sítio distante do primeiro contato ( por exemplo células hepáticas ), a estimativa da dose toxicologicamente significativa é menos confiável.

         O s termos Efeito e Resposta, muitas vezes podem ser usados como sinônimos para denominar uma alteração biológica, num indivíduo ou numa população em relação à uma exposição ou dose. Contudo, na Toxicologia se diferenciam, utilizando o termo “efeito” para denominar uma alteração biológica e o termo “resposta” para indicar a proporção de uma população que manifesta um efeito definido.

         Segundo esta terminologia, a resposta é a taxa de incidência de um efeito. Por exemplo, se pode dizer que o valor de DL50 é a dose que causará uma resposta de 50% em uma população em que se estuda o efeito letal de uma substância química.

         Alguns efeitos podem ser medidos em uma escala graduada de intensidade ou gravidade, relacionando sua magnitude diretamente com a dose e por isso são denominados Efeitos Graduados. Certos efeitos, no entanto, não permitem gradação e se podem expressar somente dizendo que estão “presentes” ou “ausentes”. Estes efeitos se denominam Efeitos Quânticos, como por exemplo, a morte ou ocorrência de um tumor.

4.1 - Curvas dose-efeito e dose-resposta

         As relações dose-efeito e dose-resposta são representadas pelas curvas correspondentes.

         A curva dose-efeito demonstra a relação entre a dose e a magnitude de um efeito graduado, em um indivíduo ou em uma população. Estas curvas podem adotar distintas formas, lineares ou não.
Exemplo: relação entre a % de carboxiemoglobina no sangue e a intensidade dos sinais e sintomas da intoxicação.

         A curva dose-resposta representa a relação entre a dose e a proporção da população que responde com um efeito quântico. Em geral estas curva são sigmóides.

Uma forma de explicar a configuração das curvas dose-resposta é dizer que cada indivíduo de uma população tem uma “tolerância” própria e requer uma certa dose antes de responder com um efeito. A princípio, existem tanto uma dose baixa a qual ninguém responderá como uma dose alta a qual todos responderão.

A razão deve-se à variabilidade biológica, isto é, à diferente sensibilidade dos indivíduos (ou animais) à ação de determinada substância química.

É importante mencionar que, para cada efeito haverá, então, uma curva dose-resposta distinta.

Além de que a configuração da curva dose-resposta da mesma substância química e a mesma espécie animal pode variar com as mudanças das condições experimentais, por exemplo, as mudanças na forma de distribuição da dose no tempo (frequência).

A curva sigmóide ou em forma de S é uma expressão curvilínea comumente observada na maior parte das curvas dose-resposta.

O fundamento biológico desta relação se pode compreender parcialmente quando se pensa na natureza da distribuição de frequência das suscetibilidades ou resistências individuais em uma população.

A maior parte das pessoas que compõem uma população responderão próximo a um nível de dose média, sendo poucas as que responderão somente a níveis de dose muito baixos ou muito altos. Isto dá lugar a uma curva de distribuição normal de frequência, geralmente utilizando escala logarítmica de dose, a qual se apresenta como uma distribuição simétrica

Uma relação dose-resposta se apresentará como uma distribuição acumulativa de frequência porque o indivíduo que reage a uma dose baixa também reagirá, naturalmente, à dose mais elevadas.

Em consequência, a frequência de indivíduos reativos a uma dose elevada determinada inclui todos aqueles que respondem a essa dose e a todas as doses inferiores.

No entanto, a equação matemática correspondente à curva sigmóide é difícil de manusear e, por isso é levada a se transformar em uma linha reta para apresentação e avaliação dos dados.

Dessa forma curva dose-resposta permite avaliar a resposta da população estudada a partir das doses, às quais 20%, 70%, 84% ou qualquer outra porcentagem da população reage a um determinado efeito.

É comum calcular as doses eficazes em se tratando de um efeito terapêutico, as quais são representadas por DE20, DE50, DE70 etc..

Ao estudar o efeito letal de um agente químico, as doses são representadas como DL20, DL50, etc.. A DL50 constitui um importante parâmetro no estudo da toxicidade de uma substância química determinado por uma relação dose-resposta.

Um outro parâmetro importante, além da DL50, é a inclinação da reta.

Por exemplo duas substâncias podem ter a mesma DL50, no entanto, qualquer afirmação a respeito da igualdade relativa de toxicidade seria válida somente à essa dose específica.

Em relação aos fármacos, além de seu efeito terapêutico , existe a possibilidade do aparecimento de um ou mais efeitos tóxicos.

A maneira de avaliar a segurança de um fármaco é comparar a relação dose-resposta obtida no estudo de um efeito biológico não tóxico ou efeito terapêutico (chamado efeito eficaz) com a relação dose-resposta obtida para o efeito tóxico.

Da comparação destas duas relações podem ser obtidos os parâmetros índice terapêutico (IT) e margem de segurança (MS), mostrados na figura a.    

                                                

         O índice terapêutico (IT) é calculado pela relação:

                            DL50

                   IT =            

                            DE50

         Onde: DL50 é a dose letal para 50% da população analisada e

                          DE50 é a dose efetiva para 50% da mesma população.

 

         Quanto maior o IT maior a segurança da substância. A desvantagem deste índice é que para calculá-lo, utiliza-se as doses médias e elas não representam, significativamente, as relações dose-resposta, como demonstrado na Figura 4. Sempre que possível é indicado um outro parâmetro que expressa segurança, qual seja a Margem de Segurança.

 

         A margem de segurança (MS) é calculada pela relação:

                             DL1

                   MS =

                             DE99

         Onde: DL1 é a dose letal para 1% da população estudada e

                          DE99 é a dose efetiva para 99% da mesma população.

 

5 - Tipos de Testes de Toxicidade

         Para estudar o potencial tóxico de uma substância química é preciso, além de estabelecer uma relação dose-resposta, proceder a realização de outors estudos toxicológicos ou testes de toxicidade. Uma das finalidades dos Testes de toxicidade é fornecer dados que possam ser utilizados para avaliação do risco do uso de substâncias químicas para o Homen e estabelecer limites de segurança na exposição aos agentes químicos.

         Após o “episódio” da Talidomida (epidemia de má formação congênita, 1959-1961, em crianças cujas respectivas mães haviam feito uso da talidomida no início da gravidez), as Instituições Governamentais, em diversos países,exigiram um maior rigor na realização dos testes toxicológicos objetivando acabar ou minimizar a ocorrência das chamadas reações adversas aos medicamentos.

         Não se tratando de medicamento, estes testes devem ser realizados para cada substância química produzida e comercializada, de acordo com os critérios já vistos anteriormente. Os tipos de testes a serem realizados, podem variar de um país para outro, no entanto devem considerar os principais critérios de avaliação de toxicidade:

Ø exame anato-patológico (aspectos macro e microscópico)
Ø peso dos órgãos
Ø crescimento do animal
Ø exames fisiológicos
Ø exames bioquímicos
Ø estudos do comportamento
Ø efeito sobre a fertilidade e feto
Ø DE50 e DL50
Ø CE50 e CL50

No Brasil, a Resolução 1/78 (D.O. 17/10/78) do Conselho Nacional de Saúde, estabelece 5 tipos de ensaios de toxicidade: Aguda, Sub-aguda, Crônica, teratogênicidade, embriotoxicidade e estudos especiais ( estudos de comportamento, carcinogênicidade e outros)

5.1 - Teste de toxicidade aguda

         Este estudo é caracterizado pela administração ou exposição da substância química numa dose única (ou múltipla num espaço de 24 horas), utilizando pelo menos duas espécies. A DL50 (e CL50) é a prova mais comum de toxicidade aguda.

         Os principais objetivos deste estudo são:
Ø avaliar a toxicidade intrínseca do Agente Toxico ou Substância Química.
Ø avaliar a suscetibilidade das espécies
Ø identificar órgãos alvo
Ø promover informações para o delineamento e seleção dos níveis de dose para estudo mais prolongados (toxicidade crônica)

5.2) Testes de toxicidade sub-crônica

O tempo de exposição deste estudo é de 1 a 3 meses. É usado 3 doses experimentais (mínima, intermediária e máxima). Sendo que a dose máxima não deve produzir um índice de letalidade acima de 10% ( para que não inviabilize as avaliações histopatógicas e bioquímicas).
         Os principais objetivos deste estudo são:

Ø determinar a dose de nenhum efeito observado – DNEO (que significa a dose máxima na qual não se observa efeito).
Ø estudar mais efetivamente órgãos alvos e determinar aqueles com mais suscetibilidade.
Ø prover dados sobre dosagens seletivas para estudo de toxicidade crônica.

5.3) Teste de Toxicidade Crônica

         Este estudo é semelhante ao sub-crônico, porém o período de exposição é de 2 anos ou quase toda a vida do anima. Como no teste anterior, este também não procura letalidade e utiliza 3 níveis de dose pela via de administração segundo a via de uso prescrita.

         O protocolo experimental compreende as observações e alterações especificadas no estudo de toxicidade sub-crônica e outros parâmetros bioquímicos que permitem uma melhor avaliação de todos os órgãos e funções, principalmente função renal e hepática.

         Os principais objetivos deste estudo são:

Ø verificar níveis máximos de dose das substâncias que não produzem efeitos discerníveis de doença quando administrados durante a maior parte da vida do animal.
Ø verificar os efeitos tóxicos que não são resultados dos estudos de toxicidade sub-crônica
Ø procura-se determinar o mecanismo de ação tóxica das substâncias químicas.

5.4) Teste de Carcinogenicidade:

         As evidências primárias que podem apontar o potencial carcinogênico das substâncias químicas são de origem epidemiológica ou experimental em roedores. Esses efeitos devem ser observados em pelo menos, duas espécies de animais de laboratório, com uma duração máxima de 130 semanas em ratos, 120 semanas em camundongos e 130 semanas em hamsters.

São utilizadas, no mínimo, 2 doses da substância. A maior dose é a dose máxima tolerada (DMT), definida como sendo aquela que não provoca no animal uma perda de peso superior a 10% e não induz mortalidade ou sinais clínicos de toxicidade. A menor dose corresponde à metade da DMT. Cada grupo experimental é constituído de, pelo menos, 50 animais. Todos animais utilizados no experimento são submetidos à necropsia completa.

         A avaliação final do risco de carcinogenicidade para o homem, além das evidências primárias, é obtida pela execução de testes de curta duração (evidências secundárias). Estes testes podem ser agrupados em 3 categorias gerais:

Ø Testes que detectam lesão do DNA, incluindo o estudo da formação de ligações entre o DNA e os produtos ativos formados na biotransformação do agente tóxico, quebra de fitas, indução de profagos e reparo do DNA
Ø Testes que evidenciam alterações dos produtos gênicos ou das funções celulares
Ø Testes que avaliam alterações cromossômicas.

         A evidência de carcinogenicidade é considerada limitada nas seguintes situações:

-         números reduzidos de experimentos
-         impropriedade de dose e vias de administração
-         emprego de uma única espécie animal
-         duração imprópria do experimento;
-         número reduzido de animais e
-         dificuldade em diferenciar as neoplasias malígnas e benígnas.

         A evidência inadequada é indicada nas seguintes situações:

-         a não exclusão do acaso nos estudos realizados;
-         a existência de vícios no delineamento experimental;
-         a existência de outros estudos que demonstrem a ausência de carcinogenicidade.

5.5) Teste de Mutagenicidade

         Os efeitos mutagênicos das substâncias químicas podem ser avaliados através de ensaios como microorganismos e em organismos superiores, inclusive o homem. Os ensaios com microorganismos, realizados "in vitro", são indicados na triagem rotineira dos agentes tóxicos. Os ensaios com microorganismos avaliam basicamente o dano provocado ao DNA pela substância química estudada ou seu produto de biotransformação.

         No estudo do potencial mutagênico de um composto, os ensaios com animais de laboratório oferecem grandes vantagens, especialmente a de reproduzir as condições de exposição do homem. Nestes ensaios, as alterações cromossômicas são identificadas na medula óssea do fêmur de ratos e camundongos expostos experimentalmente ao agente tóxico.

5.6) Teste de Teratogenicidade

         A avaliação do efeito teratogênico de um composto químico, através de métodos experimentais em animais de laboratório é executada num complexo protocolo envolvendo 3 fases distintas.

         A primeira fase tem por objetivo avaliar o potencial tóxico do composto químico sobre a fertilidade e o desempenho reprodutivo. Compreende o tratamento dos animais, machos e fêmeas, durante um período de no mínimo 60 dias antes do acasalamento e, depois, para as fêmeas durante a gestação e lactação. Ao meio termo da gravidez procede-se o sacrifício da metade doas animais do grupo experimental para a constatação de anormalidades uterinas. Ao final, são observados o número, sexo, peso corpóreo e anormalidades externas em todos os filhotes.

         Na segunda fase, as informações são obtidas a partir da administração de doses diárias da substância química na dieta de animais fêmeas grávidas no período da organogênese. Neste estudo é feita uma avaliação minuciosa e detalhada da mão e filhotes.

         Os estudos da terceira fase avaliam os efeitos as substância sobre o desenvolvimento peri e pós natal. A administração da substância química é feita durante o período que compreende o último terço da gestação até o desmame. Neste estudo é avaliado o desenvolvimento somático, neromotor, sensorial e comportamento da prole.

5.7) Testes comportamentais

         Devido uma maior preocupação da população relacionada os efeitos neurocomportamentais e os poluentes ambientais, o desenvolvimento de testes comportamentais em animais de laboratórios  têm alcançado maior relevância.

         Temos o exemplo do chumbo, que foi proibido sua adição na gasolina não pela incidência de encefalopatias e sim pelos estudos no comportamento.

         Atualmente 25% dos limites de segurança para substâncias químicas derivam de estudos no comportamento.

5.8) Estudos observados no homem

         São estudos que se realizam com o devido respeito pelos direitos da dignidade humana e submetidos a códigos de ética específicos estabelecidos por organizações nacionais e internacionais.
EX: O instrumento internacional relativo a essa questão é a Declaração de Helsinki e o artigo 7 do Pacto Internacional de Direitos Civis e Políticos adotados pela Assembléia Geral da ONU em 1966.

         Estes estudos geralmente estão relacionados à uma simulação de exposição ocupacional à agentes químicos, ou mesmo um estudo clínico desta exposição.

6) Extrapolação dos dados toxicológicos

Os testes toxicológicos que utilizam animais de laboratório são realizados em condições rigorosamente padronizadas visando estabelecer os possíveis efeitos tóxicos das substâncias em humanos a partir da extrapolação dos dados encontrados. A finalidade dos Testes Toxicológicos é portanto fornecer dados que possam ser utilizados para avaliação do risco no uso da substância química para o homem e estabelecer Limites de Segurança para a exposição química.

         Em muitos casos os estudos com animais permitem prognosticar os efeitos tóxicos das substâncias químicas no homem. Contudo, é importante compreender que os modelos de animais experimentais apresentam limitações e que a exatidão e fidedignidade de uma predição quantitativa de toxicidade no homem dependem de certas condições, como a espécie de animal escolhida, o desenho dos experimentos e os métodos de extrapolação dos dados de animais ao homem.

         O problema mais difícil na extrapolação dos dados de animais para o homem é a conversão de uma espécie a outra. Para a maior parte das substâncias químicas a patogênese da intoxicação é idêntica no homem e outros mamíferos, razão pela qual os sinais de intoxicação também são iguais. Consequentemente, são mais comuns as diferenças quantitativas na resposta tóxica do que as qualitativas.

         Embora o homem possa ser mais sensível que certos animais de laboratório, também há muitos casos nos quais algumas espécies de animais são mais sensíveis que o homem. Por exemplo, o rato é mais sensível à atropina, já o cão tolera a atropina em dose 100 vezes superior a dose letal para o homem. Entretanto o cão é mais sensível que o homem ao ácido cianídrico.
         Para estabelecer um limite de exposição para as substâncias químicas a partir de dados experimentais em animais utiliza-se um fator de segurança (FS), afim de resolver as incertezas da extrapolação.

O qual é estabelecido a partir da fórmula:
                            LT = DNEO
                                                        FS

         Em geral, a magnitude do fator de segurança dependerá:

Ø natureza do efeito tóxico
Ø tipo e tamanho da população exposta
Ø quantidade e qualidade dos dados toxicológicos

Um fator de 2 a 5 ou menos pode-se considerar suficiente quando o efeito contra o qual se protege aos indivíduos ou à uma população não se considera muito grave, quando somente um pequeno grupo de trabalhadores está sujeito à uma exposição provável e quando a informação toxicológica se deriva de dados humanos. Por outro lado, pode ser necessário recorrer a um fator de seguridade de 1000, ou mais quando o possível efeito é muito grave, quando tem que proteger uma população em geral e quando os dados toxicológicos se derivam de experimentos limitados com animais de laboratório.

         Em relação à maior parte dos aditivos alimentares que não se consideram carcinogênicos, aceita-se dividir o DNEO em animais por 100, afim de determinar a Ingestão Diária Aceitável (IDA) no homem. Nos casos dos praguicidas e certas substâncias químicas ambientais se utilizam fatores de segurança que vão de menos de 100 a mais de 1000. Nos casos de algumas exposições ocupacionais e certos contaminantes ambientais são propostos fatores de segurança muito pequenos, como 2 a 5. Também são propostos fatores de segurança para as substâncias carcinogênicas que vão de 100 a 5000.

BIBLIOGRAFIA

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